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                                                  抗菌肽[L6,K11]-IsCT抑菌性能及其穩定性研究
                                                  欄目:關于抗菌肽 發布時間:2018-07-20
                                                  抗菌肽[L6,K11]-IsCT對常見致病菌具有很強的的抑制和殺滅作用

                                                  [摘要] IsCT最初是從蝎子中分離出的一種非細胞選擇性線性抗菌肽,為了將其應用于動物飼料,需研究其對常見致病菌的抑制和殺滅作用。本試驗采用微量稀釋法和瓊脂擴散法對ISCT衍生物[L6,K11]-IsCT的抗菌活性及其穩定性進行探索。結果顯示,相對于金黃色葡萄球菌,[L6,K11]-IsCT對大腸桿菌具有更好的抑制作用,其對大腸桿菌的最小抑菌濃度為50μg/mL。另外,該衍生物對高溫表現出很好的穩定性,同時具有很好的酸堿耐受性和人工胃液耐受性。經121℃、0.12MPa處理30min,以及2.0≤pH≤11.0處理30min或人工胃液2h孵育處理后,依然能保持很好的抑菌活性。

                                                  [關鍵詞] 抗菌肽;衍生物;[L6,K11]-IsCT;抑菌活性;穩定性

                                                  抗菌肽具有較好的廣譜抑菌性能,對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌等均有不同程度的抑制作用(劉忠淵等,2003)。近年研究發現許多抗菌肽對某些真菌、病毒及癌細胞等也均具有強有力的殺滅活性(許玉澄等,1998;王軍等,2005;Hans,1995)。相對于抗生素而言,具有無殘留、效價高、無毒害作用等優點(王燕,2007;盧曉風等,1999),是抗生素潛在的替代品。蝎子是中國的一種傳統名貴中藥,2000多年前就記載了蝎子的藥用史,其具有抗腫、殺蟲、抑菌和抗菌功效,其作用主要來源于蝎尾毒腺分泌的毒液。毒液的主要成分是一類由10~100個氨基酸組成的具有多種生物活性的小分子多肽,它們可以選擇性和特異性的與細胞膜上的膜蛋白相互作用,從而改變細胞對離子的通透能力,調節細胞體積、pH、膜電位、興奮性等多種細胞代謝過程和細胞分泌、激素作用和信號轉導等多種生理過程(董偉華等,1999;陳冰等,2001;肖帆等,2003)。因此,從蝎毒素中提取出的抗菌肽具有重要的理論研究意義和應用開發價值。IsCT是來源于馬達加斯加黑爪蝎(Opisthacanthusmadagascariensis)毒液里的一種細胞毒性(cytotoxic)的線性肽(Dai等,2001),其分子質量為1502.9u,由不含半胱氨酸的13個氨基酸殘基組成,富含疏水氨基酸(3個Ile,2個Leu)和堿性氨基酸(2個Lys),具有良好的抑菌性能,但由于對哺乳動物紅細胞具有溶血活性(Blondelle等,1993;Subbalakshmi等,2000),所以其應用受到了一定的限制。有報道指出,作為IsCT的衍生物,[L6,K11]-IsCT具有極低的溶血性(Subbalakshmi等,2000;Lee等,2004),其分子質量大小為1459u,有著廣泛的應用前景。目前,對于其具體的抗菌活性及環境穩定性少有報道。本試驗旨在通過微量稀釋法和瓊脂擴散法檢測其抑菌性能及環境穩定性,為該類產品在動物飼料中的應用奠定基礎。
                                                   

                                                    1、材料與方法  
                                                   

                                                  1.1 受試體和試劑 
                                                  試驗用抗菌肽[L6,K11]-IsCT由深圳市圣西馬生物技術有限公司研發中心自制,純度為95.1%;金黃色葡萄球菌和大腸桿菌購自廣東省微生物菌種保藏中心,編號分別為ATCC8739、ATCC6538;胃蛋白酶、胰蛋白酶購自上海生工生物工程技術服務有限公司;80萬單位的氨芐青霉素購自石家莊制藥集團;其余常用試劑為國產分析純試劑。


                                                  1.2 主要儀器和設備
                                                  V-1600可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司);KE1106精密臺式pH計(武漢科易科技有限公司);TGL-168高速臺式離心機(Beckman);不同量程的移液器(Thermo);超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司);Φ90mm平皿;Φ5mm 打孔器。

                                                  1.3 培養基及各種處理液
                                                  ①LB液體培養基:牛肉膏10g、蛋白胨10g、氯化鈉5g,加水定容至1000mL,pH7.2,1×105Pa(121℃)高壓滅菌20min。
                                                  ②LB固體培養基:除液)高壓滅菌20min,備用?;虿捎?5g營養瓊脂配制1000mL固體培養基。
                                                  ③Mueller-HintonationBroth培養基:參照GB/T4789.28-2003的方法配制。MH平板:配制1000mLMH培養基加入15g瓊脂。溶解后1×1055 Pa(121 ℃ )高壓滅菌20 min,冷卻至80℃后倒平板備用。
                                                  ④人工胃液:取1、0.25、0.125g胃蛋白酶,分別與1.64mL1mol/L稀鹽酸、80mL蒸餾水混勻,均定容至100mL,備用。
                                                  ⑤人工腸液:磷酸二氫鉀0.68g,加水50 mL,用0.4%的氫氧化鈉溶液調節pH至6.8;另分別取1、0.25、0.125g胰蛋白酶,加水適量使其溶解,兩液混合后,均定容至100mL,備用。

                                                  1.4 抗菌肽產品抑菌性及穩定性的測定
                                                  1.4.1 瓊脂擴散法測定抗菌肽[L6,K11]-IsCT抑菌活性
                                                  參考Huimark等(1980)介紹的瓊脂擴散法測定抗菌肽的抑制活性。采用普通瓊脂培養基,活化培養后菌液濃度稀釋成106~107CFU/mL。在無菌操作下,注入加熱融化的培養基20mL于直徑9cm的培養皿中,使其在底部均勻分布,當冷卻到不燙手(45℃)時,分別向每個培養皿中加入2mL菌懸液,搖勻,凝固后,在無菌操作條件下用已消毒的打孔器(Φ5mm)打孔,剔除中間瓊脂,然后用移液槍注入各試驗組待測樣品,平放于37℃恒溫培養箱中培養15h,觀察小孔周圍有無抑菌圈及抑菌圈大小。抑菌圈大小測定方法:以抑菌圈的直徑減去加樣孔直徑(5mm)。

                                                  1.4.2 微量稀釋法測定抗菌肽[L6,K11]-IsCT 對大腸桿菌的最小抑菌濃度 
                                                  以無菌蒸餾水溶解抗菌肽[L6,K11]-IsCT,制成3200μg/mL 的抗菌肽溶液,再以MH 培養基對其進行倍比稀釋,使其終濃度為1600、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL,于U型微量板每孔加入100μL。將以MH培養基活化培養的大腸桿菌菌液濃度稀釋到106~107CFU/mL后,作為接種菌液。在U型微量板每孔加入5μL菌液,另1孔為不含藥物的培養基,作為對照。37℃恒溫培養箱中培養15h后,觀察結果。結果判斷:在小孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC,當陽性對照孔(即不含抗菌物質)細菌明顯生長試驗才有意義。當在微量肉湯稀釋法出現單一的跳孔時,應記錄抑制細菌生長的最高藥物濃度;如出現多處跳孔,則不應報告結果,需重復試驗。


                                                  1.4.3 抗菌肽[L6,K11]-IsCT 熱穩定性的測定

                                                  將配制好的0.5mg/mLpH7.0的抗菌肽[L6,K11]-IsCT 溶液分裝至6支EP管,分別于4、37、55、75、95℃水浴處理30min;另一組于121℃、0.12MPa處理30min,同時以無菌水和未處理的抗菌肽作對照,然后通過瓊脂擴散法檢測其對大腸桿菌的抑菌活性。


                                                  1.4.4 不同pH緩沖液對抗菌肽[L6,K11]-IsCT抑菌活性的影響 

                                                  按Huimark等(1980)配制pH2.0~11.0緩沖液,將抗菌肽[L6,K11]-IsCT用pH2.0~11.0緩沖液配制成終濃度為0.5mg/mL溶液,37℃孵育30min,瓊脂擴散法檢測其對大腸桿菌的抑菌活性,以pH2.0~11.0緩沖液為對照。


                                                  1.4.5 抗菌肽[L6,K11]-IsCT 對胃蛋白酶穩定性研究 
                                                  取抗菌肽[L6,K11]-IsCT分別與不同胃蛋白酶濃度的人工胃液配制成相應的0.5mg/mL抗菌肽溶液,放入37℃恒溫水浴鍋中分別反應1、2h,再放入70℃恒溫水浴10min,使酶失活。瓊脂擴散法測定反應物抑菌活性,以未處理的抗菌肽溶液和不同胃蛋白酶濃度的人工胃液為對照。

                                                  1.4.6 抗菌肽[L6,K11]-IsCT 對胰蛋白酶穩定性研究 
                                                  取抗菌肽[L6,K11]-IsCT分別與不同胰蛋白酶濃度的人工腸液配制成相應的0.5mg/mL抗菌肽溶液,放入37℃恒溫水浴鍋中分別反應1、2h,再放入70℃恒溫水浴10min,使酶失活。瓊脂擴散法測定反應物抑菌活性,以未處理的抗菌肽溶液和不同胰蛋白酶濃度的人工腸液為對照。


                                                    2、結果與分析  

                                                  2.1 瓊脂擴散法鑒定抗菌肽[L6,K11]-IsCT 的抑菌活性 
                                                  0.5mg/mL[L6,K11]-IsCT對大腸桿菌(a)和金黃色葡萄球菌(b)的抑菌效果見圖1。由圖1可知,抗菌肽[L6,K11]-IsCT對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌效果,且存在一定差異。其中對大腸桿菌抑菌效果更為明顯,金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑略小,且抑菌圈邊緣較為模糊,說明該抗菌肽[L6,K11]-IsCT對于革蘭氏陰性菌效果優于革蘭氏陽性菌。



                                                  2.2 抗菌肽[L6,K11]-IsCT 對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC) 
                                                  微量稀釋法測定抗菌肽[L6,K11]-IsCT對大腸桿菌的最小抑菌濃度,培養15h后,結果見表1。由表1可知,[L6,K11]-IsCT對大腸桿菌的MIC為50μg/mL。


                                                  表1   微量稀釋法測定抗菌肽對大腸桿菌的MIC

                                                  注:“+”表示肉眼可以清晰看見細菌生長;“—”表示細菌生長抑制,肉眼未見培養基渾濁或沉淀。


                                                  2.3 抗菌肽[L6,K11]-IsCT 熱穩定性的測定
                                                   
                                                  將配制好的0.5mg/mLpH7.0的抗菌肽[L6,K11]-IsCT溶液,分別于4、37、55、75、95、121℃,處理30min后,檢測其對大腸桿菌的抑菌活性,測量抑菌圈大小,結果見圖2。由圖2可知,經過各溫度處理后的抗菌肽[L6,K11]-IsCT產生的抑菌圈大小沒有發生變化(均為6mm),甚至經過高溫121℃處理,對大腸桿菌的抑菌性能依舊沒有明顯變化,說明抗菌肽[L6,K11]-IsCT對高溫具有很強的耐受性。


                                                  2.4 pH 對抗菌肽[L6,K11]-IsCT抑菌活性的影響
                                                  抗菌肽[L6,K11]-IsCT經過pH2.0~11.0緩沖液處理后,觀測其對大腸桿菌的抑菌效果,測量抑菌圈大小,結果見圖3。由圖3可知,在pH為6.0和7.0時抑菌圈最大,為6mm,而在pH為2.0~5.0和9.0~11.0時,抑菌圈降至5mm。說明了酸堿環境對[L6,K11]-IsCT抑菌活性有一定程度的影響,但整體而言,[L6,K11]-IsCT在極端pH環境中仍能維持較高的抑菌活性。由此可見,該抗菌肽[L6,K11]-IsCT具有較好的酸堿耐受性,在不同的pH 環境中具有較好的穩定性。

                                                  2.5 人工胃液對[L6,K11]-IsCT 抑菌活性的影響
                                                  以不同胃蛋白酶濃度的人工胃液配制好抗菌肽[L6,K11]-IsCT溶液(0.5mg/mL),分別于37℃恒溫水浴1、2h后終止反應,觀測反應物對大腸桿菌的抑菌效果,測量抑菌圈大小,結果見圖。由圖4可知,當胃蛋白酶濃度為1.25mg/mL時,處理1、2h后,[L6,K11]-IsCT抑菌活性沒有發生變化,抑菌圈仍為6mm;而當胃蛋白酶濃度為10mg/mL時,處理2h后,[L6,K11]-IsCT抑菌活性有一定的損耗,抑菌圈降到了4.5mm。表明[L6,K11]-IsCT抑菌活性會隨著胃蛋白酶濃度的升高和處理時間延長有一定的損耗,但整體仍能保持較高的抑菌水平,足見其對人工胃液具有較好的耐受性。



                                                  2.6 人工腸液對[L6,K11]-IsCT 抑菌性能的影響
                                                  按照已述試驗方法,采用胰蛋白酶濃度為0.625mg/mL的人工腸液處理抗菌肽[L6,K11]-IsCT(0.5mg/mL),結果見圖5。由圖5可知,處理1h后,其活性完全喪失。


                                                   

                                                    3、討論  

                                                  抗菌肽與傳統抗生素的作用機制有明顯的不同。在解釋抗菌肽的抗菌機制時,現在比較流行的有“桶-板”模型、“毯式”模型(Tim 等,2006)?!巴?板”模型認為抗菌肽通過以下步驟表現出殺菌活性:①陽離子型的抗菌肽與細菌外膜上帶負電的磷脂分子,借靜電作用吸附而結合;②通過分子雙親性結構中疏水段的疏水作用,使分子插入到膜脂雙分子層內,擾亂膜的分子結構;③抗菌肽分子間移動、聚集成“桶”樣的通道結構,該結構的外圍疏水基團與膜脂肪鏈結合,中央的親水性基團形成跨膜離子通道,從而使胞內離子大量泄漏,滲透壓發生改變,而起殺菌作用?!暗靥骸蹦P驼J為雙親性α-螺旋結構的抗菌肽與膜磷脂分子作用后,可擾亂膜脂分子原來的排列秩序,改變細胞膜的結構和功能,而起到殺菌作用。

                                                  通過體外抑菌試驗,采用瓊脂擴散法測定了抗菌肽[L6,K11]-IsCT對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌性能。試驗結果表明,[L6,K11]-IsCT對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有抑制作用,但具體采用上述哪種膜定位方式有待于進一步研究。另外,研究結果發現相對于金黃色葡萄球菌,[L6,K11]-IsCT對大腸桿菌具有很好的抑制作用,說明抗菌肽[L6,K11]-IsCT對革蘭氏陰性菌抑菌效果優于革蘭氏陽性菌。其原因可能為:①革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞壁結構和肽聚糖交聯方式不同所引起的(肖鳳偉等,2012);②抗菌肽品種和結構均不相同,[L6,K11]-IsCT為線性分子,表現出較強的陽離子特征,且缺乏分子內二硫鍵,相比其他種類抗菌肽,其一級結構(即氨基酸殘基排列順序、數目、種類)、二級結構(α2螺旋、β2轉角、β2片層)表現出明顯差異,結構不同直接導致性質的不同(Dai等,2001)。進一步通過微量稀釋法檢測了[L6,K11]-IsCT對大腸桿菌的最小抑菌濃度,其結果為50μg/mL。

                                                  以大腸桿菌為指示菌,采用瓊脂擴散法檢測其在不同環境中的穩定性。研究結果表明,[L6,K11]-IsCT對高溫具有很好的耐受性,即使經過121℃高溫處理,其活性仍然能維持不變。所以,抗菌肽[L6,K11]-IsCT能夠耐受飼料加工過程中高溫的劇烈條件,且可以在飼料保存過程中持續發揮其功能,保持飼料品質,延長貯存期限。同時[L6,K11]-IsCT經極端pH環境處理后,其抑菌活性僅有較小程度的損耗,所以在動物飼喂過程中,[L6,K11]-IsCT能夠很好的耐受不同酸堿環境,保證其順利到達作用部位。另外,在人工胃液中,[L6,K11]-IsCT會隨著胃蛋白酶濃度的提高和處理時間的延長,而加劇活性損失,但活性損失幅度不大,可見其對人工胃液的耐受性還是較為理想的。

                                                  重組表皮生長因子(rhEGF)是一種小分子多肽類物質。取重組人表皮生長因子(rhEGF)分別加入到人工胃液(pH2.0)、人工腸液(pH6.8)和加胃蛋白酶的人工胃液、加胰酶的人工腸液中,定時取樣,采用放射免疫分析法測定不同時間內rhEGF含量,結果發現,rhEGF在人工胃液和人工腸液中的含量隨時間的延長而呈下降趨勢,1h后人工胃液和人工腸液中,rhEGF濃度分別下降43.46%和21.91%;但在酶的存在下1h后rhEGF濃度分別下降89.62%和79.52% (葉盛英等,2003)。同樣,本試驗發現,即使沒有[L6,K11]-IsCT的存在,胰蛋白酶濃度為10、2.5和1.25mg/mL的人工腸液也能產生明顯的抑菌圈;而當胰蛋白酶濃度達到0.625mg/mL時,沒有抑菌圈出現。所以,選取胰蛋白酶濃度為0.625mg/mL的人工腸液處理抗菌肽,結果發現,處理1h后,其活性完全喪失。這可能與[L6,K11]-IsCT序列中具有胰蛋白酶能夠識別酶切位點有關,而且[L6,K11]-IsCT為線性肽,不能像其他抗菌肽一樣形成空間結構隱藏酶切位點,所以不能抵抗胰蛋白酶的作用。

                                                  因此,要想將[L6,K11]-IsCT更好的應用于產品開發,應避免與酶的長時間接觸,可以將該類產品制成緩釋劑,當到達作用部位后,再將產品釋放出來,這樣可以縮短產品與酶的接觸時間,發揮局部治療作用,或在產品中加入抑酶劑等,有待于進一步研究。



                                                   

                                                    本篇重點摘錄  

                                                  研究抗菌肽[L6,K11]-IsCT對常見致病菌的抑制和殺滅作用,結果發現:
                                                  1.相對于金黃色葡萄球菌,抗菌肽[L6,K11]-IsCT對大腸桿菌具有更好的抑菌作用,說明抗菌肽[L6,K11]-IsCT對革蘭氏陰性菌效果優于革蘭氏陽性菌。
                                                  2.抗菌肽[L6,K11]-IsCT對大腸桿菌的最小抑菌濃度為50μg/mL。
                                                  3.抗菌肽[L6,K11]-IsCT對高溫具有很強的耐受性,即使經過121℃高溫處理,其活性仍維持不變。所以,抗菌肽[L6,K11]-IsCT能耐受飼料加工過程中高溫的劇烈條件,且可在飼料保存過程中保持飼料品質,延長貯存期限。
                                                  4.抗菌肽[L6,K11]-IsCT具有較好的酸堿耐受性,在動物飼喂過程中,可很好地耐受不同酸堿環境,保證其順利到達作用部位。
                                                  5.抗菌肽[L6,K11]-IsCT對人工胃液具有較好的耐受性。

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